내부표준물질(IS)과 서로게이트를 가르는 것은 물질이 아니라 투입 시점이다. 추출을 마친 뒤 주입 직전 추출액에 넣은 IS는 추출 효율의 영향을 받지 않으므로 주입량과 검출기 응답의 변동만 보정한다. 전처리 전 시료에 넣는 서로게이트는 추출·정제 전 과정을 함께 거치므로 시료마다 회수율을 보여 주지만, 결과를 보정하지는 않고 판정에만 쓴다. 전처리 손실까지 결과에서 보정하려면 동위원소 표지 IS를 전처리 초기에 넣는 방식이 필요하다. 이때 표지 IS 자체의 회수율은 주입 직전에 넣는 두 번째 IS로 확인한다. 어느 방식을 쓰든 회수율 판정 기준은 적용 시험법이 정한 값을 따른다.
목차
먼저 정할 것: 어느 단계의 오차를 잡으려는가
IS와 서로게이트는 같은 종류의 화합물일 수 있다. 실제로 같은 동위원소 표지 화합물이 어떤 시험법에서는 서로게이트로, 다른 시험법에서는 IS로 쓰인다. 역할을 정하는 것은 물질의 이름이 아니라 언제 넣느냐다. 투입 시점 이후에 일어나는 오차만 그 물질에 반영되기 때문이다.
– 주입 직전에 최종 추출액에 넣으면 추출·정제에서 생긴 손실은 이 물질에 전혀 반영되지 않는다. 남는 것은 주입 부피, 검출기 응답 드리프트, (LC-MS/MS의 경우) 이온화 단계의 매트릭스 효과다. 이것이 일반적인 IS의 위치다.
– 전처리 시작 전에 시료에 넣으면 추출, 정제, 농축, 재용해를 분석물과 함께 거친다. 이 물질의 회수량이 곧 그 시료의 전처리 성적표가 된다. 이것이 서로게이트의 위치다.
– 시료 채취 단계에서 넣으면 채취 중 손실까지 반영된다. 다만 HPLC 시험실 업무에서는 드문 경우다.
Restek의 교정 해설 글(2024)은 이 관계를 세 문장으로 정리한다. 추출 후 첨가는 기기 드리프트와 매트릭스 효과만 보정하고, 추출 전 첨가는 추출 효과까지 보정하며, 채취 전 첨가는 채취 중 손실까지 보정한다는 것이다. 따라서 할 일은 전처리 흐름도를 그린 뒤, 잡고 싶은 오차가 생기는 단계보다 앞에 투입점을 두는 것이다.
한눈에 보는 차이
| 구분 | 내부표준물질(IS, 주입 직전 투입형) | 서로게이트 |
|---|---|---|
| 투입 시점 | 전처리를 마친 최종 추출액, 또는 재용해 용매에 포함 | 추출 전 시료(바탕시료·QC 시료 포함 모든 시료) |
| 반영되는 오차 | 주입량 변동, 검출기 응답 드리프트, 이온화 매트릭스 효과 | 추출·정제·농축 손실과 매트릭스 영향 전체 |
| 결과에 대한 작용 | 분석물/IS 응답비로 검량선을 만들어 결과를 직접 보정 | 보정하지 않음. 시료별 회수율로 결과의 유효성을 판정 |
| 이탈 시 해석 | 주입·기기·이온화 문제 의심 | 해당 시료의 전처리 실패 또는 매트릭스 간섭 의심 |
| 물질 조건 | 분석물과 거동이 유사하고 피크가 구별될 것 | 분석물과 유사하고 시료에 원래 없으며 피크가 구별될 것 |
두 번째 행이 핵심이다. 주입 직전에 넣은 IS는 전처리 손실을 보지 못한다. 따라서 IS 응답이 안정적이라는 사실은 회수율이 좋다는 증거가 되지 않는다. 반대로 서로게이트는 회수율을 보여 주지만 결과값을 고치지는 않는다. Restek 해설도 서로게이트는 대개 교정된 회수율로 영향을 감시할 뿐 보정하지 않는다고 구분한다.
서로게이트는 보정이 아니라 판정에 쓴다
서로게이트 회수율은 서로게이트 정량값을 첨가량으로 나누어 구한다. 이때 서로게이트도 분석물과 같은 정량 절차(IS를 쓰는 경우 같은 IS 기준의 상대 응답)로 정량해야 다른 시료와 비교할 수 있다.
판정의 쓰임새는 시료 단위라는 점에 있다. 매트릭스 스파이크는 배치를 대표하는 한두 시료에서만 회수율을 보여 준다. 서로게이트는 모든 시료에 들어가므로, 같은 배치 안에서 유독 지방이 많거나 탁도가 높은 시료 하나의 전처리 실패를 잡아낸다.
LC-MS/MS 시험법인 EPA 537.1(음용수 PFAS)이 이 구조의 전형이다. SCIEX 응용 노트에 따르면 서로게이트는 250 mL 시료 용기에 넣고, IS는 고상추출 후 재용해 용매(메탄올/물)에 포함해 넣는다. 같은 노트의 검량선 결과(Calibration curve results) 부분에는 'Surrogate recovery +/- 30% of expected response', 즉 서로게이트 회수율이 기대 응답의 ±30%라는 조건이 적혀 있다. 이 수치는 해당 시험법의 기준일 뿐이다. 다른 매트릭스나 다른 시험법에 옮겨 쓸 수 있는 일반 기준이 아니며, 회수율 허용범위는 반드시 적용 시험법이 정한 값을 방법서에 옮긴다.
서로게이트 회수율로 분석물 결과를 나누어 '회수율 보정'을 하는 것은 서로게이트의 원래 용도가 아니다. 서로게이트와 분석물은 유사할 뿐 같은 물질이 아니므로 손실률도 다를 수 있다. 회수율 보정이 필요하다면 시험법이 그 방식을 명시하고 있는지 먼저 확인한다. 명시가 없다면 서로게이트 결과는 '적합/부적합 판정, 부적합 시 재추출 또는 결과 표기'에만 쓴다.
가상 예시: 한 배치의 서로게이트 회수율 판정
아래 값은 가상(교육용) 데이터다. 8개 시료에 서로게이트를 각각 50 ng씩 추출 전에 넣었다. 허용범위는 적용 시험법이 정한 값을 그대로 쓰고, 이 예시에서는 시료 4만 그 범위를 벗어났다고 가정한다.
시료 4에서 서로게이트가 32 ng으로 정량되었다면 회수율은 32/50×100 = 64%다. 이 시료가 시험법의 허용범위를 벗어났다면, 분석물 결과는 IS로 보정되어 있더라도 그대로 보고하지 않는다. 같은 배치의 다른 시료는 범위 안에 있다. 따라서 시약이나 기기 문제보다 이 시료의 매트릭스나 전처리 조작을 먼저 의심하고, 시험법이 정한 조치(재추출, 희석 재분석, 결과 표기)를 따른다.
시료 8처럼 회수율이 다른 시료보다 높게 나오는 경우도 같은 방식으로 본다. 정제가 덜 되어 간섭 피크가 서로게이트와 겹쳤거나, LC-MS/MS에서 이온화 증강이 생겼을 가능성을 확인한다.
둘 다 쓰는 경우, 그리고 IS를 전처리 초기에 넣는 경우
선택지는 세 가지로 정리된다.
1) IS만 쓴다: 전처리가 없거나 단순 희석뿐이고, 주입·응답 변동이 주된 오차일 때. 이 글의 범위 밖인 함량 시험이 대표적이다.
2) 주입 직전 IS와 서로게이트를 함께 쓴다: 환경·식품 잔류물질처럼 다단계 전처리를 거치는 시료에서 가장 흔한 구성이다. IS는 응답을 보정하고, 서로게이트는 시료별 회수율을 판정한다. EPA 537.1이 이 구성이다.
3) 동위원소 표지 IS를 전처리 초기에 넣는다(동위원소 희석): 전처리 손실까지 결과에서 보정해야 할 때 쓴다. 표지 화합물은 분석물과 화학적으로 거의 같아 추출에서도 같은 비율로 손실된다고 보고, 분석물/표지체 응답비로 정량한다. Restek 해설은 이것을 사실상 '추출 전 IS'라고 설명한다.
3)에는 함정이 있다. 손실이 응답비 안에서 상쇄되기 때문에, 회수율이 매우 낮아 감도가 무너진 시료도 결과값만으로는 정상처럼 보인다. 그래서 EPA 533, 1633 같은 PFAS 시험법은 추출 전 IS와 추출 후 IS를 함께 쓴다. Restek 해설에 따르면 추출 전 IS로 분석물의 응답계수를 만들고, 추출 후 IS로 추출 전 IS의 응답계수를 만들어 표지체 자체의 회수율을 교정된 값으로 계산한다. 결국 전처리 초기에 넣은 표지 IS가 서로게이트의 판정 역할까지 겸하는 구조다.
전처리 초기에 넣더라도 표지체가 아닌 구조 유사체로는 손실 보정이 기대만큼 되지 않을 수 있다. 라파티닙 LC-MS/MS 연구(Wu 등, 2013)에서는 환자 6명의 혈장 회수율이 16–56%로 최대 3.5배 차이 났다. 혼합 혈장으로 한 밸리데이션은 비표지 IS로도 통과했지만, 개별 환자 시료의 회수율 차이는 동위원소 표지 IS만 보정했다. 반대로 표지 IS도 완벽하지는 않다. 채소 중 농약 25종을 본 연구(Banno 등, 2024)에서는 분석물과 표지 IS의 매트릭스 효과 차이가 평균 2%로 작았지만, 6개 쌍에서는 유의한 차이가 나타났다. 표지 IS를 쓰더라도 대표 매트릭스에서 보정 성능을 확인하는 단계를 생략하지 않는다.
검출기에 따라 달라지는 물질 선택
UV·FLD 검출에서는 동위원소 표지 화합물이 분석물과 같은 스펙트럼을 내고 거의 같은 머무름시간에 용리되므로 구별할 수 없다. 이 경우 IS와 서로게이트 모두 구조 유사체를 써야 한다. 조건은 세 가지다. 분석물·간섭물과 피크가 분리될 것, 실제 시료에 존재하지 않을 것, 해당 매트릭스의 바탕시료에서 같은 머무름시간에 간섭이 없을 것. 또한 구조 유사체 서로게이트는 분석물과 손실률이 다를 수 있으므로, 판정용이라는 원칙을 더 엄격하게 지킨다.
LC-MS/MS에서는 질량으로 구별되므로 동위원소 표지체를 쓸 수 있다. 같은 물질을 여러 역할에 나눠 쓸 때는 표지 위치와 질량 차이가 서로 다른 화합물을 배정한다. 예를 들어 서로게이트용과 IS용 표지체가 같은 전이(transition)를 공유하면 역할 구분이 무너진다. 서로게이트는 정량 대상 분석물과 겹치지 않는 표지체를 고른다.
IS 자체의 선택 기준(유사성, 안정성, 순도, 분리, 무간섭)은 내부표준물질 선택 기준 글(https://onlymymanual.com/%eb%82%b4%eb%b6%80%ed%91%9c%ec%a4%80%eb%ac%bc%ec%a7%88-%ec%84%a0%ed%83%9d-%ea%b8%b0%ec%a4%80/)에서, 내부표준법 자체를 쓸지 여부는 HPLC 내부표준법 선택 글(https://onlymymanual.com/hplc-%eb%82%b4%eb%b6%80%ed%91%9c%ec%a4%80%eb%b2%95-%ec%84%a0%ed%83%9d/)에서 다룬다.
방법서에 반영할 항목 체크리스트
전처리 흐름도에 투입점을 표시한 다음, 아래 항목을 방법서 문장으로 확정한다.
– [ ] 흐름도의 각 단계(균질화, 추출, 정제, 농축, 재용해, 주입) 중 서로게이트와 IS의 투입 단계를 명시했다.
– [ ] 서로게이트 첨가 후 추출 전 평형 시간과 혼합 방법을 정했다(고체 시료는 특히 중요).
– [ ] 서로게이트를 바탕시료, QC 시료, 검량용 표준을 포함해 어느 시료에 넣는지 정했다.
– [ ] 서로게이트를 정량하는 방식(어떤 IS 기준, 어떤 검량선)과 회수율 계산식을 적었다.
– [ ] 회수율 허용범위의 출처를 적용 시험법의 조항으로 적었다. 시험법에 값이 없으면 시험실이 정한 관리기준과 그 산정 근거를 적었다.
– [ ] 이탈 시 조치(재추출, 희석 재분석, 결과 표기, 배치 전체 재검토 조건)를 적었다.
– [ ] 동위원소 희석을 쓰는 경우, 표지 IS 자체의 회수율을 확인하는 추출 후 IS와 그 판정 방법을 넣었다.
– [ ] UV·FLD에서는 구조 유사체의 분리와 바탕시료 무간섭을 밸리데이션 기록으로 남겼다.
– [ ] 서로게이트 회수율을 배치별로 관리도에 기록해 경향을 추적한다.
회수율을 산출하고 허용범위를 정하는 일반 절차는 회수율 측정 실무 글(https://onlymymanual.com/%ed%9a%8c%ec%88%98%ec%9c%a8-%ec%b8%a1%ec%a0%95/)을 참고한다.
자주 나오는 질문
Q. IS를 추출 전에 넣으면 그것이 서로게이트인가?
A. 결과 보정에 쓰면 IS(추출 전 IS, 동위원소 희석)이고, 보정하지 않고 회수율 판정에만 쓰면 서로게이트다. 같은 물질이라도 계산에서 맡는 역할로 구분한다. 시험법의 용어 정의를 그대로 따른다.
Q. 시험법이 정한 IS 대신 다른 물질을 써도 되는가?
A. 시험법마다 다르다. 미국 EPA SW-846의 8000 시리즈 FAQ는 방법서에 나열된 IS가 필수가 아닌 권고라고 답한다. 대신 대상 분석물의 머무름시간 범위를 적절히 포괄함을 보이도록 요구한다. 국내 공정시험기준이나 식품공전 시험법은 해당 조문이 우선한다.
Q. 서로게이트를 넣으면 매트릭스 스파이크를 생략해도 되는가?
A. 둘은 대체 관계가 아니다. 서로게이트는 대리 물질의 시료별 회수율이고, 매트릭스 스파이크는 실제 분석물의 배치 대표 회수율이다. 적용 시험법이 요구하는 QC 항목을 각각 따른다.
이어서 볼 글: 내부표준물질 농도 최적화 5단계 — HPLC 감도·정밀도·분리 균형
근거 자료
- US EPA SW-846 Frequent Questions: 8000 Series (페이지 최종 갱신 2026-03-10) — Internal standards 관련 Q&A(Method 8260 질의)
- Restek — More Than You Ever Wanted to Know About Calibrations, Part 7: Internal Standards, Surrogates, and Isotope Dilution (2024)
- SCIEX — Analysis of PFAS in drinking water with EPA method 537.1 and the SCIEX QTRAP 4500 system
- Wu et al. (2013) A stable isotope-labeled internal standard is essential for correcting for the interindividual variability in the recovery of lapatinib from cancer patient plasma — PMC
- Banno et al. (2024) Investigation of variability in the matrix effect on stable isotope-labeled internal standards in LC-MS/MS analysis of 25 pesticides in vegetables — PMC
