용량인수(현재 명칭은 머무름인자, retention factor) k는 (tR − tM)/tM으로 계산한다. 필요한 측정값은 분석물 피크의 머무름시간 tR과, 머무르지 않는 성분이 컬럼을 통과하는 홀드업 시간 tM 두 개다. 대부분 오류는 tM에서 생긴다. 그래서 tM을 크로마토그램에서 어떻게 읽는지, 컬럼 치수로 어떻게 검산하는지, tM을 잘못 읽으면 k가 작은 피크일수록 오차가 커진다는 점을 가상(교육용) 데이터로 보인다. 분석법 개발 단계의 목표 범위로는 2 < k < 10(허용 1 < k < 20)이라는 실무 권고가 있다. k를 옮길 때 HPLC는 이동상 용매 세기, GC는 오븐 온도가 주된 수단이다. 유속을 바꾸면 tR과 tM이 같은 비율로 변하므로 k는 그대로다.
목차
답: k = (tR − tM) / tM이고, 크로마토그램에서 읽을 값은 두 개다
용량인수는 다음 식으로 구한다.
k = (tR − tM) / tM
– tR (머무름시간): 주입부터 분석물 피크 정점까지의 시간
– tM (홀드업 시간, dead time, void time, t0): 고정상에 전혀 머무르지 않는 성분이 주입부터 검출기까지 가는 데 걸리는 시간
분자 tR − tM은 보정 머무름시간(t'R)으로, 분석물이 고정상에 머문 시간을 뜻한다. 따라서 k는 분석물이 고정상에 머문 시간을 이동상에 머문 시간으로 나눈 비이고, 단위가 없다. 고정상과 이동상에 있는 분석물 양의 비로 정의하기도 한다. 예전에는 capacity factor(k')라고 불렀고, 지금 문헌과 기기 소프트웨어는 retention factor(k)라는 이름을 주로 쓴다. 이 글에서 용량인수 k'와 머무름인자 k는 같은 값을 가리킨다.
k는 tR을 tM으로 정규화한 값이다. 그래서 tR 자체와 달리 컬럼 길이나 유속이 바뀌어도 성분이 고정상과 얼마나 강하게 상호작용하는지를 비교할 수 있다. 분석법 개발과 조건 최적화에서 tR보다 k를 먼저 보는 이유가 여기에 있다. 머무름시간과 피크의 일반적인 의미는 이 사이트의 기본 원리 글에서 다루고, 이 글은 k를 계산하고 판단하는 방법에만 집중한다.
tR과 tM은 크로마토그램의 어디에서 읽나
tR은 피크 정점 시간이다. 데이터 처리 소프트웨어가 피크마다 자동으로 보고하므로 적분이 정상인지만 확인하면 된다.
tM이 실제로 틀리기 쉬운 값이다.
– HPLC: 크로마토그램 앞부분의 첫 번째 기준선 흔들림(시료 용매 피크나 머무르지 않는 성분)이 tM이다. 이 흔들림은 시료에 머무르지 않는 물질이 얼마나 들어 있느냐에 따라 작은 굴곡일 수도, 스케일을 넘는 큰 피크일 수도 있다. 읽는 지점은 머무르지 않는 마커 피크의 정점 시간으로 잡는다. 역상 HPLC에서는 머무르지 않는 마커로 우라실을 주입해 tM을 정하는 방법을 흔히 쓴다.
– GC: 메테인처럼 검출이 쉽고 머무르지 않는 작은 기체 분자를 주입해 그 머무름시간을 tM으로 쓴다. 최근 데이터 시스템은 컬럼 치수와 분석 조건으로 홀드업 시간을 자동 계산하기도 한다.
소프트웨어 결과의 k를 그대로 쓰기 전에, 그 계산에 들어간 tM이 실제 마커 피크에서 읽은 값인지, 사용자가 입력한 고정값인지, 컬럼 치수로 계산한 이론값인지 먼저 확인한다. 세 경우 모두 k가 같은 식으로 계산되지만, tM이 틀리면 모든 피크의 k가 함께 틀어진다.
읽은 tM이 맞는지 컬럼 치수로 검산한다
크로마토그램에서 읽은 tM은 컬럼 부피를 추정해 검산할 수 있다. LCGC의 Dolan은 다음 경험식을 제시한다.
– 내경 4.6 mm 컬럼: VM ≈ 0.01 × L (VM 단위 mL, L 단위 mm). 예: 150 mm × 4.6 mm 컬럼이면 VM ≈ 1.5 mL
– 다른 내경: VM ≈ 0.5 × L × dc² / 1000 (L·dc 단위 mm). 예: 50 mm × 2.1 mm 컬럼이면 VM ≈ 0.11 mL
– tM = VM / F (F는 유속, mL/min)
이 추정은 완전 다공성 입자 충전 컬럼에서 대략 ±10% 안에 든다고 한다. 150 mm × 4.6 mm 컬럼을 1.0 mL/min으로 흘리면 tM은 약 1.5분으로 예상된다. 읽은 값이 이 추정에서 크게 벗어나면 다른 흔들림을 tM으로 잘못 잡았는지, 유량 문제나 배제 현상이 있는지 의심한다.
다만 ±10%라는 폭은 k가 작은 피크에서는 무시할 수 없는 오차를 만든다. 다음 예제가 이를 보여 준다. 컬럼 치수 추정값은 검산에만 쓰고, k 보고에는 실제로 측정한 tM을 쓰는 편이 안전하다.
계산 예제: 세 피크의 k와 tM을 잘못 읽었을 때의 영향 (가상 교육용 데이터)
아래 값은 설명을 위해 만든 가상(교육용) 데이터이며 실제 측정 결과가 아니다. 조건은 역상 HPLC, 150 mm × 4.6 mm 컬럼, 유속 1.0 mL/min, 등용매 용리로 가정한다.
– 측정 tM = 1.52 min (컬럼 치수 추정값 약 1.5 min과 일치)
– 피크 A: tR = 2.10 min → k = (2.10 − 1.52) / 1.52 = 0.58 / 1.52 = 0.38
– 피크 B: tR = 6.84 min → k = (6.84 − 1.52) / 1.52 = 5.32 / 1.52 = 3.50
– 피크 C: tR = 19.80 min → k = (19.80 − 1.52) / 1.52 = 18.28 / 1.52 = 12.0
(표 1, 그림 1)
tM을 잘못 읽은 경우: 같은 크로마토그램에서 용매 피크의 다른 지점을 잡아 tM을 1.40 min으로 읽었다고 하자. 1.52 min 대비 약 −8%로, 컬럼 치수 추정의 ±10% 폭 안에 든다. 그래도 k는 다음처럼 달라진다(표 2).
– 피크 A: 0.70 / 1.40 = 0.50 (약 +31%)
– 피크 B: 5.44 / 1.40 = 3.89 (약 +11%)
– 피크 C: 18.40 / 1.40 = 13.1 (약 +9%)
tM 오차는 k가 작은 피크일수록 크게 증폭된다. 피크 A는 tM을 어디서 읽느냐에 따라 k가 0.38에서 0.50까지 바뀐다. 따라서 k가 1 근처이거나 그보다 작은 피크로 k 범위를 판단할 때는 tM을 어떻게 정했는지를 기록에 함께 남긴다.
분석법 개발에서 목표로 삼는 k 범위와, 그 숫자의 성격
분석법 개발 문헌이 자주 드는 목표는 다음과 같다.
– LCGC의 Dolan(2007): 가장 좋은 크로마토그래피를 위한 목표는 2 < k < 10이다. 이 범위를 맞추지 못하는 경우가 많아서 1 < k < 20이면 일반적으로 허용 가능하다고 본다.
– Restek 기술 블로그(2021): LC 분석법에서 k 2~10이 최적이고, 2 미만이면 머무름이 부족하다고 본다.
– Harvey의 분석화학 교재: 늦게 나오는 성분의 k를 1에서 10으로 높이면 분리도가 82% 개선된다. k가 약 10을 넘으면 더 높여도 분리도 개선은 미미하다.
이 숫자들은 분석법을 개발하거나 최적화할 때 쓰는 실무 권고다. 모든 시험의 합격 기준이 아니다. 이미 승인된 공정시험기준이나 공정서 각조, 밸리데이션된 사내 시험법이 있으면 그 문서의 시스템 적합성 조건이 우선한다. k 범위를 벗어났다는 사실만으로 그 시험을 부적합으로 판정하지 않는다.
앞 예제를 이 권고에 비춰 보면 다음과 같다.
– 피크 A(k 0.38): 위 권고 범위의 하한보다 작다. 앞부분에 같이 나오는 머무르지 않는 물질이나 용매 피크와 겹칠 위험이 크고, 위에서 본 것처럼 tM 오차에도 민감하다.
– 피크 B(k 3.50): 목표 범위 안에 든다.
– 피크 C(k 12.0): 목표 범위보다 크다. 분리도 이득은 적은데 분석 시간만 길어지는 구간이다.
k가 범위를 벗어나면 어느 조건을 먼저 바꾸나
k를 움직이는 조건은 정해져 있다. 유속처럼 k를 바꾸지 못하는 조건도 있어서 우선순위를 정해 두는 편이 낫다.
| 조건 | HPLC에서의 효과 | GC에서의 효과 | 판단 |
|---|---|---|---|
| 이동상 용매 세기(역상에서는 유기용매 비율) | k를 크게 바꾼다 | 해당 없음 | HPLC에서 가장 먼저 쓰는 수단 |
| 컬럼 온도·오븐 온도 | k를 조금씩 바꾼다. 선택성에도 영향을 준다 | 온도를 낮추면 k가 커진다 | GC의 주된 수단. HPLC에서는 미세 조정용 |
| 유속 | tR과 tM이 같은 비율로 변해 k는 그대로다 | 승온 프로그램에서는 용출 온도가 바뀔 수 있다 | k를 옮기는 수단이 아니다 |
| 고정상 종류, 상비율(GC 필름 두께 등) | 머무름과 선택성이 함께 바뀐다 | 머무름과 선택성이 함께 바뀐다 | 앞의 수단으로 안 될 때 검토 |
HPLC 이동상: Dolan의 rule of three에 따르면 역상에서 유기용매 농도를 10% 바꾸면 k가 약 3배 변한다. 성분에 따라 2.5배나 4배가 될 수도 있는 대략적인 규칙이다. 예제에 적용해 보자. 유기용매를 10% 줄이면 피크 A의 k는 약 0.38 × 3 ≈ 1.1로 커진다. 하지만 피크 C는 약 12.0 × 3 ≈ 36으로 범위를 크게 벗어난다(어림 계산, 가상 데이터). 이처럼 k가 넓게 퍼진 시료는 등용매 조건 하나로 모든 피크를 범위에 넣을 수 없다. 이때는 구배 용리로 바꾸거나 고정상을 바꾸는 쪽을 검토한다. 구배 용리에서는 이동상 조성이 시간에 따라 바뀌므로 위 식으로 얻은 값을 등용매 k와 같은 의미로 비교하지 않는다.
HPLC 온도: 온도가 1 °C 바뀌면 머무름이 약 2% 바뀐다는 경험칙이 있다. k를 몇 배씩 옮기기에는 부족하고 피크 간격 미세 조정에 가깝다. 반대로 말하면, 컬럼 오븐이 불안정하면 k가 흔들리는 원인이 된다.
GC 온도: 온도를 낮추면 분석물의 증기압이 낮아져 고정상에 머무는 시간이 길어지고 k가 커진다. k가 너무 작으면 초기 온도나 승온 속도를 낮추고, 너무 크면 높이는 방향으로 검토한다.
유속은 k를 바꾸지 않는다: Dolan은 의도적이든 누설 때문이든 유속이 바뀌면 t0와 tR이 같은 비율로 변하므로 k는 일정하다고 설명한다. 유속을 높이면 분석 시간은 줄지만 k 범위 문제는 풀리지 않는다. 이 성질은 진단에도 쓸 수 있다. tR이 이동했는데 k가 그대로라면 유량(펌프·누설) 쪽을 먼저 의심하고, k까지 바뀌었다면 이동상 조성이나 온도, 컬럼 상태를 의심한다.
소프트웨어가 보고한 k를 확인할 때의 점검 항목
– [ ] k 계산에 쓰인 tM의 출처(마커 피크, 수동 입력값, 컬럼 치수 계산값)를 확인했다.
– [ ] 크로마토그램에서 tM 표시 위치가 머무르지 않는 마커 피크의 정점과 맞는지 눈으로 확인했다.
– [ ] 측정한 tM을 컬럼 치수와 유속으로 계산한 추정값(VM / F)과 비교했다.
– [ ] 컬럼이나 유속을 바꾼 뒤 처리 방법에 고정 tM 값이 남아 있지 않은지 확인했다. k 자체는 유속에 무관하지만, 옛 tM이 남아 있으면 계산된 k가 틀린다.
– [ ] k가 1 근처이거나 그보다 작은 피크는 tM 오차에 민감하다는 점을 감안해 판단했다.
– [ ] 등용매 용리인지 구배 용리인지 확인하고, 구배 조건의 값은 등용매 k 권고 범위와 직접 비교하지 않았다.
– [ ] 분석법 개발 문헌의 k 권고 범위와, 해당 시험법에 정해진 시스템 적합성 조건을 구분했다.
– [ ] k를 바꿔야 할 때 HPLC는 이동상 세기, GC는 온도부터 검토하고, 유속은 k 조정 수단에서 뺐다.
근거 자료
- 12.2: General Theory of Column Chromatography – Chemistry LibreTexts (Harvey)
- 12.3: Optimizing Chromatographic Separations – Chemistry LibreTexts (Harvey, Analytical Chemistry 2.1)
- Terminology and Nomenclature for Gas Chromatography, Part 2: Reading Chromatograms and Presenting the Data (LCGC, N. H. Snow)
- Column Dead Time as a Diagnostic Tool (LCGC, J. W. Dolan)
- The Perfect Method, Part 3: Adjusting Retention (LCGC, J. W. Dolan)
- Troubleshooting Basics, Part 3: Retention Problems (LCGC, J. W. Dolan)
- Retention Factor Formula (Restek blog, J. L. York)
- Agilent GC Terms and Definitions
