크로마토그래피 정량분석은 혼합물에서 분석 대상 성분을 분리하고, 그 성분의 검출 신호를 표준물질의 신호와 비교해 농도나 함량을 구하는 분석이다. 신뢰할 수 있는 결과를 얻으려면 대상 성분의 확인, 검량 관계, 시료 전처리와 희석 계산, 품질관리 기록을 함께 검토해야 한다.
목차
크로마토그래피 정량분석은 성분의 양을 구하는 분석이다
크로마토그래피 정량분석은 시료 속 여러 성분을 분리한 뒤, 분석 대상 성분의 검출 신호로 농도나 함량을 구하는 방법이다. 크로마토그래피는 성분마다 분리 장치를 통과하는 속도가 다른 점을 이용하는 분리 기술이며, 표준물질은 비교에 사용할 성분의 정체와 순도 또는 농도가 확인된 물질이다. 대상 성분을 다른 성분의 방해 없이 측정할 수 있고, 해당 농도 범위에서 신호와 양의 관계가 확인된 시험법에 적용한다.
예를 들어 액체 시료에서 특정 성분의 농도를 구하거나, 고체 시료에서 추출한 성분의 질량당 함량을 구하는 데 사용한다. 분석 장치가 표시한 숫자가 무엇을 뜻하는지 알려면 측정한 용액과 처음 채취한 시료를 구분해야 한다.
정성분석은 성분을 확인하고 정량분석은 양을 구한다
정성분석은 어떤 성분인지를 확인하는 분석이고, 정량분석은 그 성분이 얼마나 있는지를 구하는 분석이다. 크로마토그램은 시간에 따른 검출 신호를 그린 그래프이며, 피크는 성분이 검출될 때 나타나는 봉우리 모양의 신호이다.
머무름시간은 시료를 주입한 뒤 해당 성분의 피크가 나타나기까지 걸린 시간으로, 성분 확인에 사용하는 단서이다. 다만 다른 성분도 비슷한 시간에 나올 수 있어 머무름시간의 일치만으로 정체가 확정되지는 않는다. 피크 면적은 봉우리 아래의 신호를 합산한 값으로, 정량 계산에 흔히 사용한다.
GC는 기체크로마토그래피로, 대체로 분해 없이 기화할 수 있는 성분의 분리에 사용한다. HPLC는 고성능 액체크로마토그래피로, 선택한 용매에 녹는 비휘발성 성분이나 가열에 약한 성분 등의 분리에 사용한다. 두 방법 모두 분리한 성분의 신호를 양으로 환산한다는 정량의 기본 구조는 같다. 미국 EPA Method 8000D
정성과 정량의 역할
| 구분 | 확인할 내용 | 주요 단서 |
|---|---|---|
| 정성분석 | 어떤 성분인가 | 머무름시간 등 |
| 정량분석 | 얼마나 있는가 | 피크 면적과 검량선 |
크로마토그래피 정량분석은 시료 준비부터 시작한다
먼저 무엇의 양을 어떤 단위로 보고할지 정한다. 같은 피크를 측정하더라도 최종 용액의 농도와 원시료의 함량은 계산에 필요한 정보가 다르다.
전처리는 시료를 추출하거나 녹이고, 필요에 따라 여과·희석해 측정 가능한 상태로 만드는 과정이다. 이때 처음 취한 시료의 질량이나 부피, 추출액의 최종 부피, 추가 희석 과정을 기록한다. 표준용액은 정량 비교를 위해 농도를 알고 있는 용액이며, 표준물질의 순도나 농도 표시가 조제 계산에 어떻게 반영됐는지도 확인한다.
표준용액과 시료를 분석한 뒤 대상 피크를 확인하고 적분한다. 적분은 피크의 시작과 끝, 기준선을 정해 면적을 계산하는 처리이다. 이후 신호를 농도로 바꾸고 시료 준비 기록을 적용해 보고할 결과를 산출하므로, 분석 소프트웨어의 출력값을 사용할 때도 어느 계산까지 반영됐는지 확인한다.
시료에서 보고값까지
- 보고 대상 설정
대상 성분과 보고 단위를 정한다. - 시료와 표준용액 준비
시료량, 최종 부피, 희석 과정을 기록한다. - 분석과 피크 확인
대상 피크를 확인하고 적분한다. - 농도와 함량 환산
검량 관계와 시료 준비 기록을 적용한다.
외부표준법과 내부표준법은 비교하는 신호가 다르다
검량선은 농도를 알고 있는 표준용액의 농도와 검출 신호 사이의 관계를 나타낸 것이다. 외부표준법은 표준용액을 시료와 별도로 분석하고, 대상 성분의 신호를 직접 비교해 양을 구한다.
내부표준법은 표준용액과 시료에 비교용 성분을 넣고, 대상 성분과 비교용 성분의 신호 비를 이용한다. 내부표준물질은 이 비교용 성분을 뜻하며, 주입량이나 검출 응답의 변동을 두 성분이 비슷하게 받는 조건에서 변동의 영향을 줄일 수 있다. 외부표준과 내부표준의 비교 원리는 미국 EPA Method 8000D의 검량 설명에서 확인할 수 있다.
내부표준물질을 넣었다고 모든 손실이 보정되는 것은 아니다. 예를 들어 추출을 마친 뒤 넣은 내부표준물질은 그 전에 발생한 추출 손실을 따라가지 못한다. 따라서 방법을 선택할 때는 비교용 성분의 분리와 검출 가능성뿐 아니라, 첨가 시점과 분석 대상 성분과의 거동 차이도 살펴본다.
피크 면적에서 원시료 농도까지 계산하는 예시
다음은 외부표준법을 사용하는 가상의 예시이다. 분석 용액의 농도 x를 밀리그램/리터로 나타낼 때, 확인된 검량 범위가 1~10밀리그램/리터이고 피크 면적 y와의 관계가 y = 10,000x + 1,000이라고 가정한다. 숫자와 범위는 계산 설명을 위한 값이며 시험기준의 허용값이 아니다.
시료의 피크 면적이 51,000이면 분석 용액의 농도는 x = (51,000 − 1,000) ÷ 10,000 = 5밀리그램/리터이다. 원래 액체 시료 2밀리리터를 취해 용매를 더하고 최종 부피를 20밀리리터로 맞췄다면, 희석배수는 20 ÷ 2 = 10이다. 따라서 원시료 농도는 5 × 10 = 50밀리그램/리터로 계산된다.
이 계산은 희석 중 성분 손실이 없고 다른 보정이 필요하지 않으며, 소프트웨어가 희석배수를 아직 적용하지 않은 조건에 해당한다. 검량 범위와 비교할 값은 장치에 넣은 분석 용액의 농도인 5밀리그램/리터이다. 고체 시료를 추출했거나 농축 과정을 거쳤다면 취한 질량과 추출액 부피 등을 반영하는 별도의 환산이 필요하다.
가상의 농도 계산 예시
| 항목 | 넣은 값 또는 계산 | 결과 |
|---|---|---|
| 분석 용액 농도 | (51,000 − 1,000) ÷ 10,000 | 5밀리그램/리터 |
| 희석배수 | 20 ÷ 2 | 10배 |
| 원시료 농도 | 5 × 10 | 50밀리그램/리터 |
피크가 보이거나 면적이 크다고 정량값이 확정되지는 않는다
큰 피크가 항상 많은 양을 뜻하는 것은 아니다. 서로 다른 성분은 같은 양이어도 검출 신호가 다를 수 있고, 같은 성분도 측정 조건이 달라지면 응답이 변할 수 있다. 따라서 전체 피크 면적에서 차지하는 비율을 곧바로 질량비나 순도로 읽으려면 그 환산이 타당한 조건인지 먼저 확인한다.
피크가 겹치면 다른 성분의 신호가 대상 피크 면적에 포함될 수 있다. 선택성은 함께 존재하는 다른 성분의 방해를 구별해 대상 성분을 측정하는 능력이다. 매트릭스는 시료에서 분석 대상 이외의 성분 전체를 뜻하며, 표준용액과 시료의 매트릭스 차이도 결과에 영향을 줄 수 있다.
검출한계는 성분의 존재를 검출할 수 있는 낮은 수준이고, 정량한계는 적절한 정확도와 정밀도로 양을 구할 수 있는 낮은 수준이다. 정확도는 결과가 기준값에 얼마나 가까운지, 정밀도는 반복 측정값이 얼마나 서로 가까운지를 뜻한다. 따라서 작은 피크가 확인되더라도 신뢰할 수 있는 정량값을 보고할 수 있는지는 별도로 검토한다. ICH Q2(R2)의 용어와 성능 평가 설명
같이 보면 좋은 글은 검량선 원리, 피크 면적이 농도가 되는 이유이다.
결과를 쓰기 전 시험법과 품질관리 기록을 확인한다
품질보증인 QA는 분석의 품질을 확보하는 계획과 관리 체계이고, 품질관리인 QC는 그 체계 안에서 수행하는 실제 점검이다. 공시험은 분석 대상 시료를 넣지 않고 정해진 시약이나 과정을 거쳐 오염과 방해 신호를 살펴보는 시험이다. 검량 확인용 표준용액은 분석 중에도 기존 검량 관계가 유지되는지 확인하는 데 사용한다.
회수율은 알려진 양을 넣었을 때 분석 과정에서 그 양이 얼마나 측정되는지를 나타내는 값이다. 반복 주입은 같은 용액을 장치에 여러 번 넣는 점검이므로, 시료를 따로 취해 전처리까지 반복한 결과와 평가 범위가 다르다. 이런 기록을 함께 살펴야 장치의 변동과 시료 준비 과정의 영향을 구분할 수 있다.
EPA의 SW-846 자료는 환경·폐기물 분석의 품질관리 맥락에서 작성됐으며, 개별 시험법의 구체적인 지침을 함께 확인하도록 설명한다. 이 글의 일반적인 분석 흐름을 국내 모든 공정시험기준의 절차로 옮겨 읽어서는 안 된다. 미국 EPA의 품질보증 안내
ICH Q2(R2)는 상업용 의약품 원료와 제품의 출하·안정성 시험 등에 사용하는 분석법의 성능 검증을 다루는 지침이다. 분석법 성능 검증은 해당 방법이 의도한 용도에 맞는지를 자료로 입증하는 과정이다. 실제 결과를 보고할 때는 적용 시험법의 현행 판에서 대상 성분과 시료 종류, 계산식, 보고 단위 및 품질관리 조건을 확인하고, 법적 판정이 필요하면 해당 조문 원문에서 확인한다. ICH Q2(R2)의 적용 범위
정량 결과 사용 전 확인
- ✓시험법의 대상 성분과 시료 종류를 확인한다.
- ✓공시험에서 오염과 방해 신호를 확인한다.
- ✓검량 확인용 표준용액의 결과를 검토한다.
- ✓회수율과 반복 측정의 평가 범위를 확인한다.
- ✓시료량, 희석 계산과 보고 단위를 확인한다.
- ✓법적 판정은 해당 조문 원문에서 확인한다.
