음의 피크는 대개 장비 고장이 아니다. 검출 셀을 지나는 물질의 신호가 이동상으로 잡은 기준선보다 낮으면 생긴다. UV에서는 시료 용매나 성분의 흡광이 이동상보다 작을 때 나타나고, DAD에서는 성분이 기준 파장 대역에서 흡수할 때도 나타난다. RI에서는 굴절률이 이동상보다 낮을 때, 이온쌍이나 첨가제가 든 이동상에서는 평형이 깨져 생기는 시스템 피크로 나타난다. 확인은 표시·극성 설정 점검, 바탕(희석액) 주입, t0 대비 위치 확인, DAD 기준 파장 비교, 시료 용매를 이동상과 맞추는 순서로 한다. 음의 피크가 대상 피크와 겹치거나 적분 기준선을 끌어내리면 특이성 문제로 보고 승인 시험법과 실험실 절차에 따라 처리하고 기록한다.
목차
음의 피크는 ‘이동상보다 덜 보이는 물질’이 셀을 지날 때 생긴다
분석을 시작할 때 오토제로를 하면 그 순간 검출 셀을 채운 이동상의 신호가 기준이 된다. 이후 셀을 지나는 물질의 신호가 이 기준보다 크면 피크가 위로, 작으면 아래로 그려진다. 그러니 음의 피크를 보면 먼저 '이 순간 셀에 이동상보다 흡광(또는 굴절률·형광·전도도)이 작은 무언가가 들어왔다'고 해석하는 것이 출발점이다.
Shimadzu의 Nexera 문제 해결 안내도 같은 원리로 설명한다. 보통은 시료 매트릭스가 셀을 채우면 이동상만 있을 때보다 빛을 더 흡수하지만, 시료 매트릭스가 이동상보다 빛을 덜 흡수하면 기준선이 0 아래로 내려가 음의 피크가 된다. 이 안내는 일부 피크만 음이면 해당 성분의 흡광이 이동상보다 낮은 경우로, 모든 피크가 음이면 검출기 신호의 극성이나 극성을 결정하는 물리적 연결의 문제로 구분한다.
이 원리 때문에 음의 피크는 이동상 자체가 흡광을 많이 하는 조건에서 자주 나타난다. 저파장에서 쓰는 메탄올, TFA나 아세트산염 같은 첨가제, 이온쌍 시약이 대표적이다. 첨가제는 이동상의 UV 차단 파장(cutoff)을 끌어올린다. cutoff에 가까운 파장에서 검출하면 이동상의 배경 흡광이 커진다. 이런 이동상보다 흡광이 작은 시료 용매가 셀을 지나면 아래로 꺼지는 피크가 생긴다.
전형적인 모습은 t0 부근에서 시료 용매가 지나며 생긴 함몰이 먼저 보이고, 그 뒤에 대상 성분 피크가 나오는 크로마토그램이다.
검출기 종류와 나타나는 위치로 원인 후보를 좁힌다
같은 음의 피크라도 검출기 종류와 나타나는 위치(머무름시간)에 따라 원인 후보가 다르다. 먼저 아래 두 가지를 본다.
– 모든 피크가 음인가, 일부만 음인가: 표준액의 대상 피크까지 모두 아래로 나오면 성분의 성질보다 신호 처리·설정 문제일 가능성이 크다.
– t0(비머무름 시간) 부근인가, 특정 머무름시간인가: t0 부근의 함몰은 시료 용매·용존 기체·이동상과의 조성 차이처럼 머무르지 않는 성분 때문인 경우가 많다. 특정 머무름시간에 반복해서 나오는 음의 피크는 기준 파장 대역에서 흡수하는 성분이거나, 이동상 첨가제 평형이 교란돼 생긴 시스템 피크일 수 있다.
| 검출기 | 음의 신호가 생기는 조건 | 흔한 위치 | 우선 확인할 것 |
|---|---|---|---|
| UV(단일 파장) | 셀 내용물의 흡광이 이동상보다 작음(시료 용매, 저흡광 성분, 용존 산소 차이) | t0 부근, 또는 해당 성분 위치 | 바탕(희석액) 주입, 검출 파장과 이동상 cutoff의 거리 |
| DAD/PDA | 위와 같음 + 성분이 기준 파장 대역에서 흡수해 차감이 과해짐 | 특정 성분 위치(유색 성분 등) | 기준 파장 켜짐 여부·대역, 배경 차감 설정 |
| RI | 성분·용매의 굴절률이 이동상보다 낮음, 용존 기체 차이 | t0 부근, 특정 성분 위치 | 신호 극성, 시료를 이동상에 녹였는지, 셀·컬럼 온도 안정 |
| UV·RI 공통(이온쌍·첨가제 이동상) | 주입으로 컬럼의 첨가제 평형이 일시적으로 깨져 생긴 시스템 피크 | 시료와 무관하게 재현되는 위치 | 바탕에서도 같은 위치에 나오는지, 평형화 시간 |
| 형광(비교) | 시료 쪽 용존 산소·용매에 의한 소광, 용매 자체의 형광 차이 | t0 부근 | 이동상·시료 탈기, 용매 선택 |
| IC 전도도(비교) | 주입된 물의 전도도가 억제된 용리액보다 낮음(water dip) | 데드타임 부근 | 초기 용출 이온과 dip의 분리 |
몇 가지는 원문으로 보충한다. 이온쌍 크로마토그래피에서 Dolan은 이동상보다 UV 흡광이 낮은 것(주입 용매나 시료 속 다른 시약)이 컬럼에 들어오면 음의 피크가 생기며, 이온쌍 조건에서 음의 피크와 고스트 피크가 흔하다고 설명한다. Shimadzu는 이동상을 온라인 탈기하지 않는 조건에서 시료를 헬륨으로 퍼지하면 이동상과 시료의 용존 산소량 차이로 음의 피크가 관찰된다고 안내한다. RI 검출기에서는 온라인 탈기 여부에 따라 이동상의 굴절률이 달라져 음의 피크가 생길 수 있다고 덧붙인다. KNAUER의 RI 검출기 해설은 음의 피크가 분석물의 굴절률이 이동상보다 낮다는 뜻일 뿐 반드시 시스템 오류는 아니라고 본다. 같은 해설은 수계 용매의 굴절률이 온도에 따라 약 10⁻⁴/°C(dn/dT) 변한다고 적는다.
형광과 IC는 비교용으로만 짧게 다룬다. KNAUER의 형광 검출기 해설은 용존 산소가 형광을 소광하므로 이동상을 인라인 진공 탈기기로 계속 탈기하라고 권한다. Metrohm은 억제형 전도도 검출에서 주입 피크인 water dip과 탄산 시스템 피크가 초기 용출 성분을 자주 방해한다고 설명한다.
원인 확인 순서: 설정 점검부터 시료 용매 일치까지
한 번에 하나만 바꾸고, 바꾼 조건과 결과를 그때그때 남긴다. 순서는 비용이 적고 결론이 빨리 나는 것부터 정했다.
1. 표시와 신호 설정을 확인한다(모든 피크가 음일 때 가장 먼저). 크로마토그램을 올바른 방향과 축척으로 보고 있는지, 검출기나 데이터 시스템의 신호 극성(polarity) 설정이 바뀌지 않았는지, 아날로그 출력이면 신호 케이블 극이 바뀌지 않았는지 본다. DAD/PDA에서 배경 스펙트럼 차감을 쓴다면 시료 크로마토그램이 배경으로 잘못 지정되지 않았는지도 확인한다. Shimadzu 안내는 시료 크로마토그램을 배경 스캔으로 잘못 쓰면 음의 피크가 나타날 수 있다고 적고 있다.
2. 바탕(희석액) 주입을 한다. 시료와 같은 희석액·같은 주입량으로 바탕을 주입해 같은 위치에 같은 모양의 음의 피크가 나오는지 본다. 바탕에서도 재현되면 시료 성분이 아니라 용매, 용존 기체, 시스템 피크 쪽이다. 바탕에서는 없고 시료에서만 나오면 시료 속 성분(매트릭스 포함)이 원인이다.
3. t0와 비교해 위치를 판단한다. 비머무름 표지나 용매 전선의 위치와 음의 피크 위치를 비교한다. t0 부근이면 2단계 결과와 함께 시료 용매·용존 기체 차이를 우선 의심한다. t0보다 확실히 뒤에서 재현되면 기준 파장 흡수 성분이나 첨가제 평형 교란(시스템 피크)을 의심한다.
4. DAD 기준 파장을 끄거나 옮겨서 비교한다. DAD의 기준 파장 신호는 측정 파장 신호에서 차감된다. 대상 성분이 기준 대역에서 흡수하면 차감이 과해져 피크가 줄거나 아래로 뒤집힌다. 예를 들어 기준 대역을 360 nm ± 50 nm로 잡으면 그 범위의 평균을 측정 신호에서 뺀다. 가시광을 흡수하는 유색 성분은 254 nm보다 이 대역에서 흡수가 더 클 수 있다. 원인 조사에서는 기준 파장을 끈 조건과 켠 조건을 비교한다. Agilent는 기준 파장 선택에 등흡광도(isoabsorbance) 플롯을 활용할 수 있다고 안내한다. 단, 승인 시험법이 기준 파장을 규정하고 있다면 보고용 결과는 규정 조건으로 얻어야 한다. 조건을 바꾼 주입은 원인 확인용이며 그 결과를 보고값으로 바꿔 쓰지 않는다.
5. 시료 용매를 이동상(초기 조성)에 맞춘다. 시험법이 허용하는 범위에서 이동상 또는 초기 이동상과 같은 조성의 용매로 녹인 시료(또는 표준액)를 주입해 함몰이 줄어드는지 본다. 첨가제가 든 이동상이면 희석액에도 같은 첨가제를 같은 농도로 넣는 방식이 흔히 쓰인다. RI에서는 시료를 이동상에 직접 녹이는 것이 기본이다. 희석액 변경은 시험법 변경에 해당할 수 있으므로 조사 목적의 비교 주입과 시험법 변경 절차를 구분한다. 피크 갈라짐·프론팅을 막기 위한 용매 세기 맞추기는 별도 글에서 다뤘다. 여기서는 흡광·굴절률을 이동상과 맞추는 목적이다.
6. 탈기와 온도를 확인한다. 시료만 따로 탈기(초음파·헬륨 퍼지)했는지, 이동상 온라인 탈기기가 정상인지 확인한다. RI는 검출기 셀과 컬럼 온도가 안정됐는지 본다.
7. 이온쌍·첨가제 이동상이면 평형과 재현성을 본다. 충분히 평형화한 뒤 바탕을 연속 주입해 음의 피크의 위치와 크기가 일정한지 확인한다. 일정하게 재현되는 시스템 피크라면 대상 피크와 분리돼 있는지가 핵심 판단이 된다.
이 순서를 거쳐도 원인이 남는다면 대개 시료 성분 자체가 이동상보다 흡광이 작은 경우다. 이때는 다음 절의 정량 영향 판단으로 넘어간다. 위 단계는 기존 '피크 소실' 글의 점검 항목(주입 실패, 램프 등)과 다르다. 음의 피크가 보인다는 것은 검출 자체는 정상이라는 뜻일 때가 많다.
정량 결과에는 어떻게 반영하나: 겹침과 적분 기준선이 판단 기준이다
음의 피크가 있다는 사실만으로 결과가 무효가 되지는 않는다. 판단 질문은 두 가지다.
– 대상 성분(또는 시험법이 정량하는 불순물)의 피크와 겹치는가?
– 대상 피크의 적분 기준선을 끌어내려 면적을 바꾸는가?
둘 다 아니면 음의 피크는 기록 대상일 뿐이다. 예를 들어 t0 부근에서 바탕에서도 재현되고, 시험법이 정량하는 피크들과 충분히 떨어져 있는 경우다. 바탕·위약 크로마토그램과 비교한 결과, 위치, 대상 피크와의 거리를 시험 기록에 남긴다.
하나라도 해당하면 특이성 문제로 다룬다. 식품의약품안전처의 '의약품등 시험방법 밸리데이션 가이드라인'은 밸리데이션의 목적을 품질관리시험에 쓰는 시험방법이 의도한 목적에 맞음을 증명하는 것으로 두고, 평가 항목에 특이성을 포함한다. ICH Q2(R2)도 분석법 밸리데이션의 일반 원칙을 정한 지침이다. 실무에서는 다음 순서로 처리한다.
1. 시험법 밸리데이션의 특이성 자료(바탕·위약·용매 크로마토그램)에 이 음의 피크가 이미 나와 있었는지 확인한다. 있었고 영향이 없다고 평가됐다면 그때와 위치·크기가 같은지 비교한다.
2. 밸리데이션 때 없던 음의 피크가 대상 피크와 겹친다면 새로 생긴 간섭이다. 이동상·희석액 조제, 시약 로트, 장비 설정 변경 여부를 조사한다.
3. 적분 기준선이 음의 피크 때문에 내려가 면적이 달라진다면, 적분 파라미터를 바꾸거나 수동으로 기준선을 그어 맞추고 싶어진다. 이는 실험실의 적분 절차와 사전 승인 규칙에 따라야 한다. 수동 재적분 판단과 기록은 '수동 재적분' 글의 기준을 따른다.
4. 결과가 규격에 영향을 줄 수 있으면 실험실의 일탈 또는 OOS 조사 절차로 넘긴다. 조사용 비교 주입(기준 파장 끄기, 희석액 변경 등)으로 얻은 값을 보고값으로 대체하지 않는다.
극성을 뒤집어 음의 피크를 위로 올려 적분하는 방법도 있다. RI처럼 성분의 굴절률이 이동상보다 낮아 대상 피크가 원래 음으로 나오는 조건에서는 신호 극성 설정이 시험법의 일부로 정해져 있을 수 있다. 이 경우에는 시험법이 규정한 극성으로 표준액과 시료를 같은 조건에서 처리해야 한다. 표준액과 시료의 극성 처리가 다르면 비교 자체가 성립하지 않는다. 음의 신호를 의도적으로 정량에 쓰는 간접 광도 검출법의 밸리데이션은 이 글의 범위가 아니다.
시험 기록에 남길 항목
원인 조사와 정량 판단의 근거가 다른 사람이 봐도 재구성되도록 아래를 남긴다.
– 현상: 음의 피크의 머무름시간, t0 대비 위치, 대략적 크기, 표준액·시료·바탕 중 어디에서 나왔는지
– 장비 설정: 검출기 종류, 측정 파장·대역, 기준 파장 사용 여부·대역, 신호 극성, 배경 차감 사용 여부
– 비교 주입: 바탕(희석액) 주입 결과, 기준 파장 비교, 이동상 조성 희석액 비교, 탈기 조건 비교. 각 주입이 조사용인지 보고용인지 구분
– 이동상·시료: 이동상 조제일과 첨가제 로트, 희석액 조성, 시료 전처리 중 탈기 여부
– 정량 영향 판단: 대상 피크와의 겹침 여부, 적분 기준선 영향 여부, 밸리데이션 특이성 자료와의 비교 결과
– 조치: 적분 처리(사전 승인 여부 포함), 일탈·OOS 절차 회부 여부, 재시험 사유
'음의 피크 있음, 영향 없음'처럼 결론만 적지 않는다. 바탕과 비교했는지, 대상 피크와 얼마나 떨어져 있는지처럼 결론에 이른 근거를 함께 적어야 이후 검토에서 판단을 재확인할 수 있다.
자주 나오는 질문
Q. 음의 피크가 보이면 검출기 램프나 셀을 먼저 의심해야 하나?
A. 대개 아니다. 일부 피크만 음이면 셀을 지나는 물질의 신호가 이동상보다 낮은 경우가 대부분이다. 모든 피크가 음이면 극성·연결·표시 설정을 먼저 본다. 램프 열화나 셀 오염은 잡음·드리프트·감도 저하로 나타나는 경우가 많아 음의 피크와 증상이 다르다.
Q. 기준 파장을 끄면 음의 피크가 사라졌다. 앞으로 끄고 분석해도 되나?
A. 원인은 확인된 것이다. 하지만 승인 시험법이 기준 파장을 규정했다면 임의로 끌 수 없다. 조건 변경이 필요하면 변경관리와 필요한 범위의 재밸리데이션 절차를 거친다.
Q. 그래디언트에서 기준선이 천천히 내려가는 것도 음의 피크인가?
A. 이 글에서는 구분한다. 피크 폭 수준의 짧은 함몰은 음의 피크로, 분 단위로 이어지는 기준선 이동은 드리프트로 본다. 드리프트는 이 글의 범위가 아니다.
근거 자료
- 식품의약품안전처, 의약품등 시험방법 밸리데이션 가이드라인(개정판) (2012-09-24 게시 개정판) — Ⅰ. 목적, Ⅱ. 적용범위, Ⅲ. 용어 정의(특이성)
- 식품의약품안전처 민원인안내서 (2015-12-31 발간, 안내서-0213-01) — 민원인안내서 게시글
- U.S. FDA – Q2(R2) Validation of Analytical Procedures (Final, March 2024 (Docket FDA-2022-D-1503)) — 지침 안내 페이지 개요
- Shimadzu Nexera Virtual Advisor – Troubleshooting Negative Peaks
- Shimadzu – Peaks from Dissolved Air in Sample Solvent
- Agilent Community LC Portal – Optimizing DAD Acquisition Method Settings
- Axion Labs – Reference wavelength, Peak Purity, and Threshold
- Axion Labs – HPLC Negative Peaks and Baseline Drift
- LCGC – Ion Pairing: Blessing or Curse? (J.W. Dolan)
- KNAUER – Detection Made Easy Part 4: Refractive Index Detector
- KNAUER – Detection Made Easy Part 5: Fluorescence Detectors
- Metrohm – Detection methods in ion chromatography
