각조에 적힌 RRT는 따로 적지 않으면 tM을 빼지 않은 미보정 값이다. 계산식은 불순물 tR ÷ 기준 피크 tR이다. tM을 뺀 상대머무름 r로 계산해 각조 값과 비교하면 앞쪽 피크일수록 어긋난다. 계산값은 후보 피크를 좁히는 데만 쓴다. 배정을 확정할 때는 시스템적합성 용액이나 피크 식별용 표준물질로 확인하고, 시험기록에는 계산 정의, 기준 피크, 확인 근거를 남긴다.
목차
답: 각조 RRT는 따로 적지 않으면 tM을 빼지 않은 값이다
공정서 유연물질 항에 적힌 '상대머무름시간 약 0.8'은 대부분 불순물 머무름시간을 기준 피크 머무름시간으로 그대로 나눈 값이다.
– 미보정 상대머무름(RRT, rG) = tR,i ÷ tR,ref
– 상대머무름(r) = (tR,i − tM) ÷ (tR,ref − tM)
Ph. Eur. 2.2.46(크로마토그래피 분리기법)은 두 식을 따로 정의한다. 그리고 각조(monograph)에 적힌 상대머무름 값은 따로 표시하지 않는 한 미보정 상대머무름이라고 규정한다. 이 장과 국제 조화된 USP <621>은 같은 미보정 값을 RRT(relative retention time)라고 부른다. 그래서 각조 값과 대조할 내 값은 기본적으로 tM을 빼지 않고 계산한다. 다만 계산값은 후보 피크를 좁히는 용도로만 쓴다. 배정을 확정하려면 각조가 정한 시스템적합성 용액이나 피크 식별용 표준물질의 크로마토그램과 맞춰 봐야 한다.
이 글에서는 tM을 측정하는 절차와 머무름지수, 머무름시간 변동 원인, 상대감응계수(RRF) 보정은 다루지 않는다. 마지막 절에 해당 글을 연결해 두었다.
두 정의를 나란히 놓고 보기
| 항목 | 미보정 RRT (rG) | 상대머무름 r |
|---|---|---|
| 계산식 | tR,i ÷ tR,ref | (tR,i − tM) ÷ (tR,ref − tM) |
| tM 측정 | 필요 없음 | 필요함(비머무름 마커 또는 각조가 정한 tM) |
| 공정서 각조의 기본값 | 별도 표시가 없으면 이 값 | 각조가 명시할 때만 |
| 두 값의 차이가 커지는 곳 | — | tM에 가까운 앞쪽 피크 |
| 등용매에서 유량만 바뀔 때 | 이론상 유지 | 이론상 유지 |
| 기울기 지연부피(dwell volume)가 다를 때 | 바뀐다(앞쪽 피크일수록 더 크게) | 역시 바뀐다 |
r은 tM을 빼서 고정상에 머문 시간끼리 비교한다. 그래서 등용매 조건에서는 두 피크의 머무름인자 비(k_i ÷ k_ref)와 같은 값이 된다. 기울기 용리나 GC 승온 조건에서는 머무름인자가 분석 도중 계속 바뀐다. 이때는 tM을 빼도 조건에 대한 의존이 사라지지 않으므로, 각조는 흔히 미보정 값을 쓴다. 요점은 어느 값이 더 좋으냐가 아니다. 각조가 쓴 정의와 내가 계산한 정의가 같아야 한다는 것이다.
각조가 어느 정의를 쓰는지 확인하는 곳
다음 순서로 확인한다.
1. 공정서 일반 규정: Ph. Eur.와 USP는 앞에서 본 것처럼 각조의 상대머무름 값을 기본적으로 미보정 값으로 본다. 대한민국약전 각조도 '상대머무름시간 약 ○○'처럼 적는다. 실제로 판정할 때는 현행 고시본의 일반시험법 크로마토그래피 항에서 용어 정의를 다시 확인한다.
2. 각조 문구: '○○에 대한 상대머무름'처럼 기준 피크가 적혀 있는지 본다. 비머무름 마커나 tM 산출 방법이 따로 지정되어 있으면 보정값(r)일 수 있다. 이런 경우에는 각조 본문을 따른다.
3. 사내 시험법·밸리데이션 보고서: 공정서가 아닌 시험법은 보고서의 계산식 항목을 본다. 식이 적혀 있지 않으면 개발 당시 크로마토그램의 tR 값으로 두 정의를 모두 계산해 보고, 문서 값과 맞는 쪽을 찾는다.
4. 크로마토그래피 데이터 시스템(CDS) 설정: 처리 방법에서 RRT 필드의 기준 피크와 계산식(tM 차감 여부)을 확인한다. 시험법과 CDS 계산이 다르면 결과표의 RRT는 각조 값과 비교할 수 없다.
기준 피크를 고를 때 주의할 점
– 기준 피크가 늘 주성분은 아니다. 각조가 다른 지정 불순물이나 내부표준을 기준으로 정했으면 그 피크의 tR로 나눈다.
– 어느 용액의 주피크인가. 유연물질 시험의 시험액은 주성분 농도가 높다. 그래서 주피크가 과부하로 끌리거나 앞으로 쏠려 꼭짓점이 움직일 수 있다. 각조나 시험법이 기준 피크를 어느 용액에서 읽도록 정했는지 확인한다. 정한 바가 없으면 어느 용액의 tR을 썼는지 기록에 남긴다.
– 염·반대이온 피크와 혼동하지 않는다. 염 형태의 원료에서는 반대이온이나 첨가제 피크가 앞쪽에 나올 수 있다. 각조가 무시하라고 지정한 피크인지 먼저 대조한다.
– 기준 피크를 확인하지 않은 채 RRT를 계산하지 않는다. 시스템적합성 용액에서 기준 피크의 정체를 먼저 확정해야 한다. 그다음에 나눈 값이 의미를 갖는다.
계산 예제: 같은 크로마토그램을 두 정의로 계산하면
아래 값은 모두 가상(교육용) 데이터다. 등용매 HPLC로 유연물질을 시험한다고 가정한다. 각조에는 '불순물 A: 주성분에 대한 상대머무름시간 약 0.8, 불순물 B: 약 1.2'라고 적혀 있다. 비머무름 마커의 tM은 1.20분이고, 주피크 tR은 10.00분이다. 시료 크로마토그램에 P1(7.85분), P2(8.10분), P3(12.40분) 피크가 나타났다.
계산 과정은 다음과 같다.
– P1: RRT = 7.85 ÷ 10.00 = 0.785, r = (7.85 − 1.20) ÷ (10.00 − 1.20) = 6.65 ÷ 8.80 = 0.756
– P2: RRT = 8.10 ÷ 10.00 = 0.810, r = 6.90 ÷ 8.80 = 0.784
– P3: RRT = 12.40 ÷ 10.00 = 1.240, r = 11.20 ÷ 8.80 = 1.273
전체 값은 표 1에 정리했다. 이 예에서 읽을 점은 세 가지다.
1. 정의를 섞으면 대조가 어긋난다. 각조 값은 미보정 RRT다. 그런데 r로 계산하면 P1, P2가 0.76, 0.78로 내려가 '약 0.8'에서 멀어진다. 앞쪽 피크일수록 tM을 빼는 효과가 커지기 때문이다.
2. '약 0.8'에 해당하는 후보가 둘이다. 미보정 RRT로 계산하면 P1(0.785)과 P2(0.810)가 모두 각조 값 근처에 있다. 둘의 차이는 0.025다. 같은 시퀀스에서 P1의 RRT를 6회 주입으로 계산하면 평균 0.7853, 표본표준편차 0.0010, RSD 0.13%다(표 2, 가상). 내 시스템 안의 반복 흔들림은 두 후보 간격보다 훨씬 작다. 그러니 문제는 계산 정밀도가 아니다. 각조 값이 '약'으로 주어진 근사값이라서 두 후보를 가를 수 없는 것이다.
3. 확정은 계산 밖에서 한다. 이럴 때는 각조의 시스템적합성 용액이나 피크 식별용 표준물질을 같은 시퀀스에 주입한다. 불순물 A가 어느 쪽에 나오는지 확인하고, 그 용액에서 얻은 A의 RRT를 내 시스템 값으로 기록한다. P3(1.240)은 B 후보가 하나뿐이어도 같은 방식으로 확인한다.
각조 RRT로 불순물 피크를 배정하는 순서
1. 정의와 기준 피크를 확정한다. 미보정인지 보정인지, 누구를 기준으로 나누는지, 어느 용액의 기준 피크인지 확인한다.
2. 기준이 되는 크로마토그램을 먼저 얻는다. 각조의 시스템적합성 용액(분리도 확인용 혼합액, 피크 식별용 표준물질 함유 용액 등)이나 지정 불순물 표준용액을 시료와 같은 시퀀스로 주입한다. 그 용액에서 지정 불순물의 tR과 RRT를 내 시스템 값으로 읽는다. 이후 시료 대조의 기준은 각조에 적힌 근사값이 아니라 이 값이다.
3. 시료 피크를 같은 정의로 계산해 후보를 나열한다. 각조 값 근처의 피크를 모두 적는다. 앞에서 본 것처럼 후보가 여럿일 수 있다.
4. 후보가 여럿이거나 값이 어긋나면 보조 근거를 더한다.
– 용출 순서: 시스템적합성 용액에 나타난 피크 순서와 시료의 피크 순서를 맞춰 본다.
– 첨가(스파이크) 주입: 시료에 해당 불순물 표준물질을 넣었을 때 어느 피크가 커지는지 본다.
– 스펙트럼: DAD UV 스펙트럼이나 MS 질량을 표준물질과 비교한다. 같은 RRT에 다른 성분이 겹치는 공용출 가능성도 함께 본다.
5. 밸리데이션 자료와 맞춘다. ICH Q2(R2)의 특이성 평가에서 각 불순물 피크의 배정 근거(표준물질 주입, 첨가 시험, 강제분해 시료)가 남아 있다면, 일상 시험의 배정은 그 근거와 같은 방식이어야 한다.
6. 배정 결과와 근거를 기록한다. 마지막 절의 체크리스트를 쓴다.
구조를 모르는 불순물은 RRT 자체가 이름 역할을 한다. ICH Q3A(R2)는 규격에 올린 미확인 불순물을 상대머무름 값을 붙인 정성 표기로 부르는 예를 든다. 이런 불순물은 표준물질이 없으므로 시스템적합성 용액에 나타나는 이웃 지정 피크와의 상대 위치, 밸리데이션 당시 크로마토그램을 기준으로 추적한다.
컬럼·유량·기울기가 바뀌어 값이 어긋날 때
RRT는 비율이므로 상쇄되는 변화와 상쇄되지 않는 변화가 있다.
– 상쇄되는 변화: 등용매에서 유량만 일정하게 달라지면 tM과 모든 tR이 같은 비율로 늘거나 줄어든다. 이 경우 RRT와 r 모두 이론상 그대로다.
– 상쇄되지 않는 변화:
– 기울기 지연부피 차이: 기기를 바꾸면 기울기가 컬럼에 도달하는 시점이 달라진다. 이 지연은 모든 피크에 거의 같은 시간을 더하거나 빼므로, 비율인 RRT가 변한다. 앞쪽 피크일수록 더 많이 변한다.
– 선택성 변화: 컬럼 제조사·로트, 이동상 pH, 컬럼 온도, GC 승온 속도가 바뀌면 피크마다 이동 폭이 다르다. 용출 순서가 뒤바뀔 수도 있다.
– 컬럼 치수 변경: 허용 조정 범위 안이라도 기울기 조건에서는 피크 간 간격이 달라질 수 있다.
그래서 조건을 바꾼 뒤 각조 RRT와 값이 맞지 않으면, 계산값을 억지로 맞추지 않는다. 시스템적합성 용액에서 지정 피크의 위치를 다시 읽고, 그 값으로 시료를 다시 대조한다. 허용되는 조정의 범위는 현행 Ph. Eur. 2.2.46, USP <621>, 대한민국약전 일반시험법 원문에서 확인한다. 어긋남의 원인이 조정이 아니라 기기 변동이면 아래 연결 글의 진단 순서를 따른다.
시험기록에 남길 것: 분석자와 QA 검토자 체크리스트
– [ ] 적용한 RRT 정의(미보정 tR,i ÷ tR,ref 또는 tM 차감 r)와 그 근거 문서(공정서 판·각조명·시험법 번호)
– [ ] 기준 피크의 이름, 그 tR을 읽은 용액(시스템적합성 용액·표준액·시료액)과 주입 번호
– [ ] r을 쓴 경우 tM 값과 산출 방법(마커 종류 또는 각조 지정 방법)
– [ ] CDS 처리 방법의 RRT 계산 설정이 시험법 정의와 같다는 확인
– [ ] 시스템적합성 용액이나 피크 식별용 표준물질에서 얻은 지정 불순물의 RRT(이 시스템 값)
– [ ] 시료의 각 배정 피크에 대해 tR, 계산한 RRT, 대조한 기준값
– [ ] 후보가 여럿이었던 경우 선택 근거(용출 순서, 첨가 주입, 스펙트럼)
– [ ] 각조 값과 어긋난 피크에 대한 판단과 근거(조건 변경 내역 포함)
– [ ] 미확인 피크의 RRT 표기 방식과 보고 처리
QA 검토자는 두 가지를 먼저 확인한다. 첫째, 결과표의 RRT가 각조 값과 같은 정의로 계산되었는가. 둘째, 배정이 계산값 하나가 아니라 같은 시퀀스의 기준 크로마토그램에 근거했는가.
이어서 볼 글
– tM을 크로마토그램에서 읽는 위치와 머무름인자 계산: 용량인수 k는 (tR − tM)/tM으로 구한다
– t₀(정체 시간) 측정과 머무름지수 계산 흐름: 정체 시간 측정 4단계
– 머무름시간·상대머무름시간 허용 창의 판정 기준: 머무름 시간 편차, 몇 %까지 허용되나
– 머무름시간이 움직일 때 원인 진단: 머무름 시간이 계속 길어질 때, GC 머무름 시간이 자꾸 변할 때 원인 찾기
이어서 볼 글: 정체 시간 측정 4단계 — 머무름 지수·상대 머무름 시간 계산
근거 자료
- British Pharmacopoeia Appendix III Chromatographic Separation Techniques (Ph. Eur. 2.2.46) (BP 2013 수록본(Ph. Eur. 2.2.46). 현행 판의 정의는 원문으로 재확인 필요) — Definitions – Relative retention (r)
- 국가법령정보센터 행정규칙 「대한민국약전」(식품의약품안전처고시)
- ICH Quality Guidelines (Q2(R2), Q3A(R2), Q3B(R2))
